Das Kartenhaus fällt…

22 internationale Wissenschaftler
fordern Widerruf von PCR-Test-Studie
von Drosten und Corman

Aus dem Abschlußprotokoll:
„Im Lichte unserer erneuten Überprüfung des im Corman-Drosten-Papier beschriebenen Testprotokolls zur Identifizierung von SARS-CoV-2 haben wir Fehler und inhärente Irrtümer identifiziert, die den SARS-CoV-2-PCR-Test unbrauchbar machen.“

22 Wissenschaftler sind beteiligt 1
ihre Studien im Rahmen dieser Arbeit 2


Originalbeitrag

aus: https://cormandrostenreview.com/report/
automatisch übersetzt mit https://www.deepl.com/home / keine Nachkorrektur!


Dieser umfassende Überprüfungsbericht wurde am 27. November 2020 offiziell über sein Einreichungsportal an die Redaktion von Eurosurveillance übermittelt. Diesem Überprüfungsbericht ist ein von allen Haupt- und Mitautoren unterzeichnetes Widerrufsschreiben beigefügt. Der erste und der letzte aufgeführte Name sind der erste und der zweite Hauptautor. Alle Namen dazwischen sind Mitautoren.

Externe Peer Review des RTPCR-Tests zum Nachweis von SARS-CoV-2 zeigt 10 wichtige wissenschaftliche Mängel auf molekularer und methodischer Ebene: Konsequenzen für falsch positive Ergebnisse.


ABSTRACT

In der Publikation mit dem Titel „Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR“ (Eurosurveillance 25(8) 2020) stellen die Autoren einen diagnostischen Arbeitsablauf und ein RT-qPCR-Protokoll für den Nachweis und die Diagnostik von 2019-nCoV (jetzt bekannt als SARS-CoV-2) vor, von dem sie behaupten, dass es validiert ist und eine robuste diagnostische Methodik für den Einsatz in Labors des öffentlichen Gesundheitswesens darstellt.

Angesichts aller Konsequenzen, die sich aus eben dieser Publikation für die Gesellschaften weltweit ergeben, führte eine Gruppe unabhängiger Forscher eine Punkt-für-Punkt-Überprüfung der genannten Publikation durch, bei der 1) alle Komponenten des vorgestellten Testdesigns gegengeprüft wurden, 2) die RT-qPCR-Protokollempfehlungen im Hinblick auf die gute Laborpraxis bewertet wurden und 3) die Parameter anhand der einschlägigen wissenschaftlichen Literatur in diesem Bereich untersucht wurden.

Das veröffentlichte RT-qPCR-Protokoll zum Nachweis und zur Diagnostik von 2019-nCoV und das Manuskript weisen zahlreiche technische und wissenschaftliche Fehler auf, darunter ein unzureichendes Primerdesign, ein problematisches und unzureichendes RT-qPCR-Protokoll und das Fehlen einer genauen Testvalidierung. Weder der vorgestellte Test noch das Manuskript selbst erfüllen die Anforderungen für eine akzeptable wissenschaftliche Publikation. Auch ernsthafte Interessenkonflikte der Autoren werden nicht erwähnt. Schließlich deutet die sehr kurze Zeitspanne zwischen Einreichung und Annahme der Publikation (24 Stunden) darauf hin, dass ein systematisches Peer-Review-Verfahren hier entweder nicht durchgeführt wurde oder von problematisch schlechter Qualität war. Wir liefern überzeugende Beweise für mehrere wissenschaftliche Unzulänglichkeiten, Fehler und Mängel.

In Anbetracht der hier dargestellten wissenschaftlichen und methodischen Mängel sind wir zuversichtlich, dass der Redaktionsausschuss von Eurosurveillance keine andere Wahl hat, als die Publikation zurückzuziehen.

KURZER ÜBERPRÜFUNGSBERICHT

Dieses Papier wird zahlreiche schwerwiegende Mängel des Corman-Drosten-Papiers aufzeigen, deren Bedeutung zu einer weltweiten Fehldiagnose von Infektionen geführt hat, die auf SARS-CoV-2 zurückgeführt werden und mit der Krankheit COVID-19 in Verbindung stehen. Wir sind mit strikten Abriegelungen konfrontiert, die das Leben und die Lebensgrundlagen vieler Menschen zerstört haben, mit eingeschränktem Zugang zu Bildung, und diese von Regierungen auf der ganzen Welt auferlegten Einschränkungen sind ein direkter Angriff auf die Grundrechte der Menschen und ihre persönlichen Freiheiten, was zu Kollateralschäden für ganze Volkswirtschaften im globalen Maßstab führt.

Mit dem Corman-Drosten-Papier sind zehn fatale Probleme verbunden, die wir in den folgenden Abschnitten skizzieren und näher erläutern werden.

Das erste und wichtigste Problem besteht darin, dass das neuartige Coronavirus SARS-CoV-2 (in der Publikation 2019-nCoV und im Februar 2020 von einem internationalen Konsortium von Virusexperten als SARS-CoV-2 bezeichnet) auf (theoretischen) in silico-Sequenzen basiert, die von einem Labor in China [1] geliefert wurden, da den Autoren zu diesem Zeitpunkt weder Kontrollmaterial von infektiösem („lebendigem“) oder inaktiviertem SARS-CoV-2 noch isolierte genomische RNA des Virus zur Verfügung stand. Bis heute hat die Autorenschaft keine Validierung auf der Grundlage isolierter SARS-CoV-2-Viren oder deren RNA in voller Länge durchgeführt. Nach Corman et al:

„Unser Ziel war es, robuste Diagnosemethoden für den Einsatz in Labors des öffentlichen Gesundheitswesens zu entwickeln und einzusetzen, ohne dass Virusmaterial zur Verfügung steht.

Der Schwerpunkt sollte hier auf die beiden genannten Ziele gelegt werden: a) Entwicklung und b) Einsatz eines diagnostischen Tests zur Verwendung in Labors des öffentlichen Gesundheitswesens. Diese Ziele lassen sich nicht erreichen, wenn kein tatsächliches Virusmaterial zur Verfügung steht (z.B. zur Bestimmung der infektiösen Viruslast). In jedem Fall kann nur ein Protokoll mit maximaler Genauigkeit das verbindliche und primäre Ziel in einem Szenario dieser Größenordnung sein. Die Bestimmung der kritischen Viruslast ist eine obligatorische Information, und es liegt in der Verantwortung der Gruppe von Christian Drosten, diese Experimente durchzuführen und die entscheidenden Daten bereitzustellen.

Dennoch wurden diese in silico-Sequenzen verwendet, um eine RT-PCR-Testmethodik zur Identifizierung des genannten Virus zu entwickeln. Dieses Modell basierte auf der Annahme, dass das neuartige Virus dem SARS-CoV aus dem Jahr 2003 sehr ähnlich ist, da es sich bei beiden um Beta-Koronaviren handelt.

Der PCR-Test wurde daher unter Verwendung der genomischen Sequenz von SARS-CoV als Kontrollmaterial für die Sarbeco-Komponente entwickelt; wir kennen dies aus unserer persönlichen E-Mail-Kommunikation mit [2] einem der Koautoren des Corman-Drosten-Papiers. Diese Methode zur Modellierung von SARS-CoV-2 wurde in dem Corman-Drosten-Papier wie folgt beschrieben:

„die Einrichtung und Validierung eines diagnostischen Arbeitsablaufs für das 2019-nCoV-Screening und die spezifische Bestätigung, der in Ermangelung verfügbarer Virusisolate oder Original-Patientenproben konzipiert wurde. Design und Validierung wurden durch die enge genetische Verwandtschaft mit dem SARS-CoV von 2003 ermöglicht und durch den Einsatz der synthetischen Nukleinsäuretechnologie unterstützt“.

Die Reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) ist eine wichtige biomolekulare Technologie zum schnellen Nachweis seltener RNA-Fragmente, die im Voraus bekannt sind. In einem ersten Schritt werden die in der Probe vorhandenen RNA-Moleküle revers transkribiert, um cDNA zu erhalten. Die cDNA wird dann in der Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines spezifischen Primerpaares und eines thermostabilen DNA-Polymerase-Enzyms amplifiziert. Die Technologie ist hochempfindlich und ihre Nachweisgrenze liegt theoretisch bei 1 Molekül cDNA. Die Spezifität der PCR wird durch biomolekulare Designfehler stark beeinflusst.

Was ist bei der Entwicklung eines RT-PCR-Tests und des in der Corman-Drosten-Publikation beschriebenen quantitativen RT-qPCR-Tests wichtig?

1. Die Primer und Sonden:

a) die Konzentration von Primern und Sonden muss im optimalen Bereich liegen
(100-200 nM)
b) muss spezifisch für das Ziel-Gen sein, das Sie verstärken wollen
c) muss einen optimalen Prozentsatz des GC-Gehalts im Verhältnis zu den gesamten Stickstoffbasen aufweisen (mindestens 40%, maximal 60%)
d) für die Virusdiagnostik müssen mindestens 3 Primerpaare 3 virale Gene nachweisen (vorzugsweise möglichst weit voneinander entfernt im viralen Genom)

2. Die Temperatur, bei der alle Reaktionen ablaufen:

a) DNA-Schmelztemperatur (>92°)
b) Temperatur der DNA-Amplifikation (TaqPol-spezifisch)
c) Tm; die Glühtemperatur (die Temperatur, bei der die Primer und Sonden die Zielbindung/Lösung erreichen, darf 2 ̊C pro Primerpaar nicht überschreiten). Tm hängt stark vom GC-Gehalt der Primer ab

3. Die Anzahl der Verstärkungszyklen (weniger als 35; vorzugsweise 25-30 Zyklen);

Im Falle des Virusnachweises werden bei >35 Zyklen nur Signale nachgewiesen, die nicht mit dem infektiösen Virus korrelieren, wie durch Isolierung in Zellkultur bestimmt [überprüft in 2]; wenn jemand durch PCR als positiv getestet wird, wenn ein Schwellenwert von 35 Zyklen oder höher verwendet wird (wie es in den meisten Labors in Europa & den USA der Fall ist), beträgt die Wahrscheinlichkeit, dass diese Person tatsächlich infiziert ist, weniger als 3%, die Wahrscheinlichkeit, dass das Ergebnis ein falsches Positiv ist, 97% [überprüft in 3].

4. Molekularbiologische Validierungen;

Amplifizierte PCR-Produkte müssen validiert werden, indem die Produkte entweder in einem Gel mit einem DNA-Lineal oder durch direkte DNA-Sequenzierung ausgeführt werden.

5. Positiv- und Negativkontrollen

sollte angegeben werden, um den spezifischen Virennachweis zu bestätigen/zu widerlegen

6. Es sollte einen Standard geben

Betriebsverfahren (SOP) verfügbar

Die SOP legt die oben genannten Parameter eindeutig fest, so dass alle Laboratorien in der Lage sind, exakt die gleichen Testbedingungen einzurichten. Eine validierte universelle SOP ist unerlässlich, da sie den Vergleich von Daten innerhalb und zwischen Ländern ermöglicht.

KLEINERE BEDENKEN GEGEN DAS CORMAN-DROSTEN-PAPIER

  1. In Tabelle 1 des Corman-Drosten-Papiers sind verschiedene Abkürzungen angegeben – „nM“ ist angegeben, „nm“ nicht. Weiter in Bezug auf die korrekte Nomenklatur bedeutet nm „Nanometer“, daher sollte nm hier nM lauten.
  2. Es ist der allgemeine Konsens, genetische Sequenzen immer in der 5′-3′-Richtung zu schreiben, einschließlich der Reverse-Primer. Es ist höchst ungewöhnlich, Alignment mit reverser komplementärer Schreibweise der Primersequenz durchzuführen, wie es die Autoren in Abbildung 2 des Corman-Drosten-Papiers getan haben. Hier ist zusätzlich eine Wackelbasis als „y“ gekennzeichnet, ohne Beschreibung der Basen, für die das Y steht.
  3. Zwei irreführende Fallstricke im Corman-Drosten-Papier sind, dass ihre Tabelle 1 weder Tm-Werte (Glühtemperaturwerte) noch GC-Werte (Anzahl von G und C in den Sequenzen als %-Wert der Gesamtbasen) enthält.

GRÖßERE BEDENKEN GEGEN DAS CORMAN-DROSTEN-PAPIER

A) HINTERGRUND

Die Autoren stellen den Hintergrund für ihre wissenschaftliche Arbeit als: „Der anhaltende Ausbruch des vor kurzem aufgetauchten neuartigen Coronavirus (2019-nCoV) stellt eine Herausforderung für die Laboratorien des öffentlichen Gesundheitswesens dar, da Virusisolate nicht verfügbar sind, während es immer mehr Anzeichen dafür gibt, dass der Ausbruch weiter verbreitet ist als ursprünglich angenommen und die internationale Ausbreitung durch Reisende bereits stattfindet“.

Laut BBC News [4] und Google Statistics [5] gab es am 21. Januar 2020 – dem Tag, an dem das Manuskript eingereicht wurde – weltweit 6 Todesfälle. Warum gingen die Autoren von einer Herausforderung für die Laboratorien des öffentlichen Gesundheitswesens aus, obwohl es zu diesem Zeitpunkt keine substanziellen Beweise dafür gab, dass der Ausbruch weiter verbreitet war als ursprünglich angenommen?

Als Ziel erklärten die Autoren die Entwicklung und den Einsatz robuster diagnostischer Methoden für den Einsatz in Laboratorien des öffentlichen Gesundheitswesens, ohne dass Virusmaterial zur Verfügung steht. Ferner räumen sie ein, dass „die vorliegende Studie die enorme Reaktionsfähigkeit demonstriert, die durch die Koordination akademischer und öffentlicher Labors in nationalen und europäischen Forschungsnetzwerken erreicht wird“.

B) METHODEN UND ERGEBNISSE

  1. Entwurf von Primer und Sonde

1a) Falsche Primer-Konzentrationen

Zuverlässige und genaue PCR-Testprotokolle werden normalerweise unter Verwendung von 100 nM bis 200 nM pro Primer erstellt [7]. In der Arbeit von Corman-Drosten beobachten wir ungewöhnlich hohe und variierende Primerkonzentrationen für mehrere Primer (Tabelle 1). Für die Primerpaare RdRp_SARSr-F und RdRp_SARSr-R werden 600 nM bzw. 800 nM beschrieben. In ähnlicher Weise wird für die Primersätze N_Sarbeco_F und N_Sarbeco_R 600 nM bzw. 800 nM empfohlen [1].

Es sollte klar sein, dass diese Konzentrationen viel zu hoch sind, um für spezifische Amplifikationen von Zielgenen optimal zu sein. Es gibt keinen spezifizierten Grund, diese extrem hohen Konzentrationen von Primern in diesem Protokoll zu verwenden. Vielmehr führen diese Konzentrationen zu erhöhter unspezifischer Bindung und PCR-Produktamplifikation.

Tabelle1: Primer und Sonden (angepasst an Corman-Drosten-Papier; fehlerhafte Primerkonzentrationen sind hervorgehoben)

1b) Nicht spezifizierte („wacklige“) Primer- und Sondensequenzen

Um reproduzierbare und vergleichbare Ergebnisse zu erhalten, ist es unerlässlich, die Primerpaare eindeutig zu definieren. Im Corman-Drosten-Papier beobachteten wir sechs nicht spezifizierte Positionen, die durch die Buchstaben R, W, M und S gekennzeichnet sind (Tabelle 2). Der Buchstabe W bedeutet, dass es an dieser Position entweder ein A oder ein T geben kann; R bedeutet, dass es entweder ein G oder ein A geben kann; M bedeutet, dass die Position entweder ein A oder ein C sein kann; der Buchstabe S bedeutet, dass es an dieser Position entweder ein G oder ein C geben kann.

Diese hohe Anzahl von Varianten ist nicht nur ungewöhnlich, sondern für Laboratorien auch höchst verwirrend. Diese sechs nicht spezifizierten Positionen könnten leicht zum Design mehrerer verschiedener alternativer Primersequenzen führen, die sich nicht auf SARS-CoV-2 beziehen (2 verschiedene RdRp_SARSr_F-Primer + 8 verschiedene RdRp_SARS_P1-Sonden + 4 verschiedene RdRp_SARSr_R). Die Designvariationen werden unweigerlich zu Ergebnissen führen, die nicht einmal mit SARS-CoV-2 in Zusammenhang stehen. Daher ist die verwirrende unspezifische Beschreibung im Corman-Drosten-Papier nicht als operationelles Standardprotokoll geeignet. Diese unspezifischen Positionen hätten unmissverständlich entworfen werden müssen.

Diese wackeligen Sequenzen haben bereits zu einer Quelle der Besorgnis in der Praxis geführt und zu einem Leserbrief von Pillonel et al. [8] über eklatante Fehler in den beschriebenen Sequenzen geführt. Diese Fehler sind auch in der Beilage von Corman et al. offensichtlich.

Tabelle 2: Primer und Sonden (nach Corman-Drosten-Papier; nicht spezifizierte („wacklige“) Nukleotide in den Primern sind hervorgehoben)

Das WHO-Protokoll (Abbildung 1), das sich direkt aus dem Corman-Drosten-Papier ableitet, kommt zu dem Schluss, dass zur Bestätigung des Vorhandenseins von SARS-CoV-2 zwei Kontrollgene (das E- und das RdRp-Gen) im Assay identifiziert werden müssen. Es ist zu beachten, dass das RdPd-Gen eine unsichere Position („wackelig“) im Forward-Primer (R=G/A), zwei unsichere Positionen im Reverse-Primer (R=G/A; S=G/C) und drei unsichere Positionen in der RdRp-Sonde (W=A/T; R=G/A; M=A/C) hat. Somit können zwei verschiedene Vorwärts-Primer, vier verschiedene Rückwärts-Primer und acht verschiedene Sonden für das RdPd-Gen synthetisiert werden. Zusammen gibt es 64 mögliche Kombinationen von Primern und Sonden!

Das Corman-Drosten-Papier identifiziert ferner ein drittes Gen, das nach dem WHO-Protokoll nicht weiter validiert und für unnötig erachtet wurde:

„Bemerkenswert ist, dass der N-Gen-Assay ebenfalls gut funktionierte, aber keiner intensiven weiteren Validierung unterzogen wurde, da er etwas weniger empfindlich war.“

Dies war ein bedauerliches Versäumnis, da es am besten wäre, alle drei Gen-PCRs als Bestätigungstests zu verwenden, und dies hätte zu einem fast ausreichenden Protokoll für ein diagnostisches Werkzeug zum Nachweis von Virus-RNA geführt. Drei Bestätigungs-Assay-Schritte würden zumindest die Fehler und Unsicherheiten bei jedem Faltschritt in Bezug auf die „Wackel“-Punkte minimieren. (Nichtsdestotrotz würde das Protokoll immer noch hinter jeder „guten Laborpraxis“ zurückbleiben, wenn man all die anderen Konstruktionsfehler mit einbezieht).

In seiner jetzigen Form wird der N-Gentest bedauerlicherweise weder in der WHO-Empfehlung (Abbildung 1) als obligatorischer und entscheidender dritter Bestätigungsschritt vorgeschlagen, noch wird er im Corman-Drosten-Papier als wichtige optionale Zusicherung „für einen routinemäßigen Arbeitsablauf“ hervorgehoben (Tabelle 2).

Folglich wurden in fast allen Testverfahren weltweit nur 2 Primer-Matches anstelle von allen drei verwendet. Dieses Versäumnis macht das gesamte Testprotokoll nutzlos, wenn es darum geht, genaue Testergebnisse zu liefern, die bei einer laufenden Pandemie von echter Bedeutung sind.

Abbildung 1: Der N-Gen-Bestätigungstest wird in der offiziellen Empfehlung des WHO-Drosten-Corman-Protokolls unten [8] weder als notwendiger dritter Schritt hervorgehoben, noch ist er als entscheidender Schritt für eine höhere Testgenauigkeit in der Eurosurveillance-Publikation erforderlich.

1c) Fehlerhafter GC-Gehalt (diskutiert in 2c, zusammen mit der Glühtemperatur (Tm))

1d) Nachweis viraler Gene

RT-PCR wird für die Primärdiagnostik einer Infektion nicht empfohlen. Aus diesem Grund ist der in der klinischen Routine verwendete RT-PCR-Test zum Nachweis von COVID-19 für die COVID-19-Diagnose auf regulatorischer Basis nicht indiziert.

„Kliniker müssen die verbesserte Genauigkeit und Schnelligkeit der molekularen Diagnosetechniken für die Diagnose von Infektionen erkennen, aber auch ihre Grenzen verstehen. Laborergebnisse sollten immer im Zusammenhang mit der klinischen Präsentation des Patienten interpretiert werden, und für zuverlässige Testergebnisse sind eine geeignete Stelle, Qualität und Zeitplanung der Probenentnahme erforderlich“. [9]

Sie kann jedoch zur Unterstützung der Differentialdiagnose des Arztes eingesetzt werden, wenn dieser zwischen verschiedenen Infektionen der Lunge unterscheiden muss (Grippe, Covid-19 und SARS haben sehr ähnliche Symptome). Für eine Bestätigungsdiagnose eines spezifischen Virus müssen mindestens 3 spezifische Primerpaare eingesetzt werden, um 3 virusspezifische Gene nachzuweisen. Vorzugsweise sollten diese Zielgene mit möglichst großem Abstand im viralen Genom lokalisiert werden (einschließlich entgegengesetzter Enden).

Obwohl das Corman-Drosten-Papier 3 Primer beschreibt, decken diese Primer nur etwa die Hälfte des Virusgenoms ab. Dies ist ein weiterer Faktor, der die Spezifität für den Nachweis von intakter COVID-19-Virus-RNA verringert und die Quote falsch positiver Testergebnisse erhöht.

Selbst wenn wir also drei positive Signale (d.h. die drei Primerpaare ergeben 3 verschiedene Amplifikationsprodukte) in einer Probe erhalten, ist dies kein Beweis für das Vorhandensein eines Virus. Ein besseres Primerdesign würde terminale Primer an beiden Enden des Virusgenoms haben. Dies liegt daran, dass das gesamte virale Genom abgedeckt wäre und drei positive Signale besser zwischen einem vollständigen (und damit potenziell infektiösen) Virus und fragmentierten viralen Genomen (ohne infektiöse Potenz) unterscheiden können. Um etwas von Bedeutung über die Infektiosität des Virus ableiten zu können, hätte das Orf1-Gen, das für das essentielle Replikase-Enzym der SARS-CoV-Viren kodiert, als Zielobjekt aufgenommen werden müssen (Abbildung 2). Die Positionierung der Targets in der Region des viralen Genoms, die am stärksten und variabelsten transkribiert wird, ist eine weitere Schwachstelle des Protokolls.

Kim et al. zeigen eine hochvariable 3′-Expression von subgenomischer RNA in Sars-CoV-2 [23]. Diese RNAs werden als Signaturen für asymptomatische und nicht infektiöse Patienten aktiv überwacht [10]. Es ist höchst fragwürdig, eine Population von asymptomatischen Personen mit qPCR-Primern zu screenen, die 6 Basenpaare Primer-Dimer am 3 primären Ende eines Primers aufweisen (Abbildung 3).
Offenbar empfiehlt die WHO diese Primer. Wir haben alle Wobble-Derivate aus dem Corman-Drosten-Papier mit dem Primer-Dimer-Web-Tool von Thermofisher getestet [11]. Der RdRp Vorwärtsprimer hat eine 6bp 3prime-Homologie mit Sarbeco E Reverse. Bei hohen Primerkonzentrationen reicht dies aus, um Ungenauigkeiten zu erzeugen.

Bemerkenswert: Es gibt eine perfekte Übereinstimmung eines der N-Primer mit einem klinischen Erreger (Pantoea), der bei immungeschwächten Patienten gefunden wurde. Der Reverse-Primer trifft auch Pantoea, aber nicht in der gleichen Region (Abbildung 3).

Dies sind schwere Designfehler, da der Test nicht zwischen dem gesamten Virus und viralen Fragmenten unterscheiden kann. Der Test kann nicht als Diagnostikum für SARS-Viren verwendet werden.

Abbildung 2: Relative Positionen von Amplikon-Targets auf dem SARS-Coronavirus und dem 2019 neuartigen Coronavirus-Genom. ORF: offener Leserahmen; RdRp: RNA-abhängige RNA-Polymerase. Zahlen unterhalb von Amplikon sind Genompositionen gemäß SARS-CoV, NC_004718 [1];

Abbildung 3: Ein Test mit dem Thermofischer Primer-Dimer-Web-Tool zeigt, dass der RdRp-Vorwärtsprimer eine 6bp 3`Prime-Homologie mit Sarbeco E Reverse aufweist (linker Kasten). Ein weiterer Test zeigt, dass einer der N-Primer perfekt zu einem klinischen Erreger (Pantoea) passt, der bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem gefunden wurde (rechter Kasten).

  1. Temperaturen bei der Reaktion

2a) DNA-Schmelztemperatur (>92°).

Ausreichend behandelt im Corman-Drosten-Papier.

2b) Temperatur der DNA-Amplifikation.

Adäquat behandelt im Corman-Drosten-Papier.

2c) Fehlerhafter GC-Gehalt und Tm

Die Annealing-Temperatur bestimmt, bei welcher Temperatur sich der Primer an die Zielsequenz anlagert bzw. von ihr ablöst. Für eine effiziente und spezifische Amplifikation sollte der GC-Gehalt der Primer mindestens 40% und maximal 60% der Amplifikation betragen. Wie in Tabelle 3 angegeben, liegen drei der im Corman-Drosten-Papier beschriebenen Primer nicht innerhalb des normalen Bereichs für den GC-Gehalt. Zwei Primer (RdRp_SARSr_F und RdRp_SARSr_R) weisen ungewöhnliche und sehr niedrige GC-Werte von 28%-31% für alle möglichen Varianten von Taumelbasen auf, während Primer E_Sarbeco_F einen GC-Wert von 34,6% aufweist (Tabelle 3 und zweites Panel von Tabelle 3).

Es ist zu beachten, dass der GC-Gehalt aufgrund seiner drei Wasserstoffbrückenbindungen in der Basenpaarung weitgehend die Bindung an sein spezifisches Ziel bestimmt. Je niedriger der GC-Gehalt des Primers, desto geringer ist also seine Bindungsfähigkeit an seine spezifische Zielgensequenz (d.h. das nachzuweisende Gen). Das heißt, damit eine Zielsequenz erkannt wird, müssen wir eine Temperatur wählen, die möglichst nahe an der tatsächlichen Annealing-Temperatur liegt (Best-Practice-Wert), damit sich der Primer nicht wieder ablöst, und gleichzeitig die Zielsequenz gezielt auswählen.

Wenn der Tm-Wert sehr niedrig ist, wie es bei allen Wobbly-Varianten der RdRp-Reverse-Primer zu beobachten ist, können die Primer unspezifisch an mehrere Targets binden, wodurch die Spezifität abnimmt und mögliche falsch positive Ergebnisse erhöht werden.

Die Annealing-Temperatur (Tm) ist ein entscheidender Faktor für die Bestimmung der Spezifität/Genauigkeit des qPCR-Verfahrens und wesentlich für die Bewertung der Genauigkeit von qPCR-Protokollen. Best-Practice-Empfehlung: Beide Primer (vorwärts und rückwärts) sollten einen nahezu ähnlichen Wert haben, vorzugsweise den identischen Wert.

Wir haben die frei verfügbare Primerdesign-Software Primer-BLAST [12, 25] verwendet, um die Best-Practice-Werte für alle im Corman-Drosten-Papier verwendeten Primer auswertbar zu machen (Tabelle 3). Wir versuchten, einen Tm-Wert von 60° C zu finden, während wir in ähnlicher Weise den höchstmöglichen GC%-Wert für alle Primer anstrebten. Ein maximaler Tm-Unterschied von 2° C innerhalb der Primerpaare wurde als akzeptabel erachtet. Bei der Prüfung der im Corman-Drosten-Papier spezifizierten Primerpaare beobachteten wir für das Primerpaar1 (RdRp_SARSr_F und RdRp_SARSr_R) einen Unterschied von 10° C bezüglich der Glühtemperatur Tm. Dies ist ein sehr schwerwiegender Fehler und macht das Protokoll als spezifisches Diagnosewerkzeug nutzlos.

Zusätzliche Tests zeigten, dass nur das Primerpaar zur Amplifikation des N-Gens (N_Sarbeco_F und N_Sarbeco_R) den adäquaten Standard für einen diagnostischen Test erreicht, da es einen ausreichenden GC-Gehalt aufweist und die Tm-Differenz zwischen den Primern (N_Sarbeco_F und N_Sarbeco_R) 1,85° C beträgt (unterhalb des entscheidenden Maximums von 2° C Differenz). Wichtig ist, dass dies das Gen ist, das weder in den Virusproben getestet (Tabelle 2) noch als Bestätigungstest hervorgehoben wurde. Zusätzlich zu den stark variablen Schmelztemperaturen und degenerierten Sequenzen in diesen Primern gibt es einen weiteren Faktor, der die Spezifität des Verfahrens beeinflusst: die dNTPs (0,4uM) sind 2x höher als für eine hochspezifische Amplifikation empfohlen. Außerdem wird der Reaktion zusätzlich Magnesiumsulfat zugesetzt. Dieses Verfahren kann in Kombination mit einer niedrigen Glühtemperatur unspezifische Amplifikationen erzeugen. Wenn zusätzliches Magnesium für die qPCR benötigt wird, sollte die Spezifität des Assays weiter untersucht werden.

Die hier beschriebenen Designfehler sind so schwerwiegend, dass es höchst unwahrscheinlich ist, dass eine spezifische Amplifikation von SARS-CoV-2 genetischem Material nach dem Protokoll des Corman-Drosten-Papiers auftritt.

3. Die Anzahl der Verstärkungszyklen

Es sei darauf hingewiesen, dass im Corman-Drosten-Papier nirgendwo erwähnt wird, dass ein Test positiv oder negativ ist oder was ein positives oder negatives Ergebnis definiert. Diese Arten von virologischen Diagnosetests müssen auf einer SOP basieren, einschließlich einer validierten und festgelegten Anzahl von PCR-Zyklen (Ct-Wert), nach denen eine Probe als positiv oder negativ eingestuft wird. Der maximale halbwegs zuverlässige Ct-Wert beträgt 30 Zyklen. Oberhalb eines Ct-Wertes von 35 Zyklen muss mit rasch ansteigenden Zahlen falsch positiver Ergebnisse gerechnet werden.

PCR-Daten, die nach einem Ct-Wert von 35 Zyklen als positiv bewertet werden, sind völlig unzuverlässig.

Zitiert nach Jaafar et al. 2020 [3]: „Bei einem Ct-Wert von 35, dem Wert, den wir für die Meldung eines positiven PCR-Ergebnisses verwendet haben, sind <3% der Kulturen positiv. Mit anderen Worten: Bei diesen hohen Ct-Werten gab es keine erfolgreiche Virusisolierung von SARS-CoV-2.

Weiter zeigen wissenschaftliche Studien, dass nur nicht infektiöse (tote) Viren mit Ct-Werten von 35 nachgewiesen werden [22].

Zwischen 30 und 35 gibt es eine Grauzone, in der ein positiver Test nicht mit Sicherheit festgestellt werden kann. Dieser Bereich sollte ausgeschlossen werden. Natürlich könnte man 45 PCR-Zyklen durchführen, wie es das Corman-Drosten WHO-Protokoll empfiehlt (Abbildung 4), aber dann muss man auch einen vernünftigen Ct-Wert definieren (der 30 nicht überschreiten sollte). Ein Analysenergebnis mit einem Ct-Wert von 45 ist aber wissenschaftlich und diagnostisch absolut bedeutungslos (ein vernünftiger Ct-Wert sollte 30 nicht überschreiten). All dies sollte sehr klar kommuniziert werden. Es ist ein wesentlicher Fehler, dass das Corman-Drosten-Papier nicht den maximalen Ct-Wert erwähnt, bei dem eine Probe eindeutig als positives oder negatives Testergebnis betrachtet werden kann. Diese wichtige Zyklus-Schwellenwertgrenze wird auch in den bisherigen Folgebeiträgen nicht angegeben.

Abbildung 4: RT-PCR-Kit-Empfehlung im offiziellen Corman-Drosten WHO-Protokoll [8]. Es ist lediglich ein „Cycler“-Wert (Zyklen) ohne entsprechenden und wissenschaftlich sinnvollen Ct (Cutoff-Wert) zu finden. Dieser oder irgendein anderer Zykluswert ist im aktuellen Corman-Drosten-Papier nirgends zu finden.

4. Biomolekulare Validierungen

Um festzustellen, ob es sich bei den amplifizierten Produkten tatsächlich um SARS-CoV-2-Gene handelt, ist eine biomolekulare Validierung der amplifizierten PCR-Produkte unerlässlich. Für einen diagnostischen Test ist diese Validierung ein absolutes Muss.

Die Validierung von PCR-Produkten sollte durchgeführt werden, indem man entweder das PCR-Produkt in einem 1%igen Agarose-EtBr-Gel zusammen mit einem Größenindikator (DNA-Lineal oder DNA-Leiter) laufen lässt, so dass die Größe des Produkts abgeschätzt werden kann. Die Größe muss der berechneten Größe des Amplifikationsprodukts entsprechen. Noch besser ist es jedoch, das Amplifikationsprodukt zu sequenzieren. Letzteres gibt 100% Sicherheit über die Identität des Amplifikationsprodukts. Ohne molekulare Validierung kann man sich über die Identität der amplifizierten PCR-Produkte nicht sicher sein. In Anbetracht der oben beschriebenen schweren Designfehler können die amplifizierten PCR-Produkte alles sein.

Auch der Fall der kleinen Fragmente der qPCR (ca. 100bp) wird im Corman-Drosten-Papier nicht erwähnt: Es könnte entweder 1,5% Agarosegel oder sogar ein Acrylamidgel sein.

Die Tatsache, dass diese PCR-Produkte nicht auf molekularer Ebene validiert wurden, ist ein weiterer auffallender Fehler des Protokolls, der jeden darauf basierenden Test als spezifisches diagnostisches Werkzeug zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus nutzlos macht.

5. Positiv- und Negativkontrollen zur Bestätigung/Widerlegung des spezifischen Virusnachweises.

Die im Corman-Drosten-Papier beschriebene unbestätigte Annahme ist, dass SARS-CoV-2 das einzige Virus aus der Gruppe der SARS-ähnlichen Beta-Koronaviren ist, das derzeit Infektionen beim Menschen verursacht. Die Sequenzen, auf denen ihre PCR-Methode basiert, sind in silico-Sequenzen, die von einem Labor in China [23] geliefert wurden, da den Autoren zum Zeitpunkt der Entwicklung des PCR-Tests kein Kontrollmaterial von infektiösem („lebendigem“) oder inaktiviertem SARS-CoV-2 zur Verfügung stand. Der PCR-Test wurde daher unter Verwendung der Sequenz des bekannten SARS-CoV als Kontrollmaterial für die Sarbeco-Komponente konzipiert (Dr. Meijer, Co-Autor Corman-Drosten-Papier in einem E-Mail-Austausch mit Dr. Peter Borger) [2].

Bei allen Personen, die mit dem RT-PCR-Test, wie im Corman-Drosten-Papier beschrieben, positiv getestet werden, wird angenommen, dass sie positiv für SARS-CoV-2-Infektionen sind. Es gibt drei schwerwiegende Fehler in ihrer Annahme. Erstens kann ein positiver Test auf die im Corman-Drosten-Papier beschriebenen RNA-Moleküle nicht mit einer „Infektion mit einem Virus“ gleichgesetzt werden. Ein positiver RT-PCR-Test zeigt lediglich das Vorhandensein von viralen RNA-Molekülen an. Wie unter Punkt 1d (oben) dargelegt, wurde der Corman-Drosten-Test nicht zum Nachweis des Virus in voller Länge, sondern nur eines Fragments des Virus entwickelt. Wir sind bereits zu dem Schluss gekommen, dass dies den Test als ungeeignet als diagnostischer Test einstuft.
für SARS-Virus-Infektionen.

Zweitens und von großer Bedeutung ist, dass die Funktionalität des veröffentlichten RT-PCR-Tests nicht mit einer Positivkontrolle (isolierte SARS-CoV-2-RNA) nachgewiesen wurde, die einen wesentlichen wissenschaftlichen Goldstandard darstellt.

Drittens heißt es im Corman-Drosten-Papier:

„Um zu zeigen, dass die Assays auch andere Fledermaus-assoziierte SARS-verwandte Viren nachweisen können, haben wir mit dem E-Gen-Assay sechs von Fledermäusen stammende Kotproben getestet, die von Drexler et al. […] und Muth et al. […] zur Verfügung stehen. Diese viruspositiven Proben stammten von europäischen Nashornfledermäusen. Der Nachweis dieser phylogenetischen Ausreißer innerhalb der SARS-verwandten CoV-Kategorie lässt vermuten, dass wahrscheinlich alle asiatischen Viren nachgewiesen werden. Dies würde theoretisch eine breite Sensitivität selbst im Falle mehrerer unabhängiger Akquisitionen von Virusvarianten aus einem Tierreservoir gewährleisten“.

Diese Aussage zeigt, dass das im RT-PCR-Test verwendete E-Gen, wie im Corman-Drosten-Papier beschrieben, nicht spezifisch für SARS-CoV-2 ist.

Die E-Gen-Primer weisen auch ein breites Spektrum anderer SARS-Viren nach.
Das Genom des Coronavirus ist das größte aller RNA-Viren, die den Menschen infizieren, und sie alle haben eine sehr ähnliche molekulare Struktur. Dennoch haben SARS-CoV1 und SARS-CoV-2 zwei hochspezifische genetische Fingerabdrücke, die sie von den anderen Coronaviren unterscheiden. Erstens ist eine einzigartige Fingerabdruck-Sequenz (KTFPPTEPTEPKKDKKKKK) im N-Protein von SARS-CoV und SARS-CoV-2 vorhanden [13,14,15]. Zweitens enthalten sowohl SARS-CoV1 als auch SARS-CoV2 das HE-Protein nicht, während alle anderen Coronaviren dieses Gen besitzen [13,14,15]. Um also ein SARS-CoV1- und SARS-CoV-2-PCR-Produkt spezifisch nachzuweisen, hätte die obige Region im N-Gen als Amplifikationsziel gewählt werden müssen. Ein zuverlässiger diagnostischer Test sollte sich als Bestätigungstest auf diese spezifische Region im N-Gen konzentrieren. Die PCR für dieses N-Gen wurde vom Drosten-Corman-Papier weder weiter validiert noch als Testgen empfohlen, weil sie mit der SARS-CoV-Originalsonde „nicht so empfindlich“ ist [1].

Darüber hinaus macht das Fehlen des HE-Gens sowohl bei SARS-CoV1 als auch bei SARS-CoV-2 dieses Gen zur idealen Negativkontrolle zum Ausschluss anderer Coronaviren. Das Corman-Drosten-Papier enthält weder diese Negativkontrolle, noch enthält es andere Negativkontrollen. Der PCR-Test im Corman-Drosten-Papier enthält daher weder eine einzige Positivkontrolle noch eine Negativkontrolle, um das Vorhandensein anderer Coronaviren auszuschließen. Dies ist ein weiterer wesentlicher Konstruktionsfehler, der den Test als ungeeignet für die Diagnose einstuft.

6. Die Standardarbeitsanweisung (SOP) ist nicht verfügbar.

Es sollte eine Standard-Arbeitsanweisung (SOP) zur Verfügung stehen, die die oben genannten Parameter eindeutig spezifiziert, so dass alle Laboratorien in der Lage sind, die gleichen Testbedingungen einzurichten. Eine validierte universelle SOP ist unerlässlich, da sie den Datenvergleich innerhalb und zwischen den Ländern erleichtert. Es ist sehr wichtig, alle Primer-Parameter eindeutig zu spezifizieren. Wir stellen fest, dass dies nicht geschehen ist. Ferner ist der Ct-Wert, der angibt, wann eine Probe als positiv oder negativ zu betrachten ist, nicht spezifiziert. Er ist ebenfalls nicht spezifiziert, wenn eine Probe als mit SARS-CoV-Viren infiziert gilt. Wie oben gezeigt, kann der Test nicht zwischen Virus und Virusfragmenten unterscheiden, daher ist der Ct-Wert, der die Positivität anzeigt, von entscheidender Bedeutung. Dieser Ct-Wert hätte in der Standardarbeitsanweisung (SOP) festgelegt und online gestellt werden müssen, so dass alle Laboratorien, die diesen Test durchführen, exakt die gleichen Randbedingungen haben. Es weist auf eine fehlerhafte Wissenschaft hin, dass es eine solche SOP nicht gibt. Den Labors steht es somit frei, den Test so durchzuführen, wie sie es für angemessen halten, was zu einer enormen Variationsbreite führt. Laboratorien in ganz Europa stehen vor einer Vielzahl von Fragen; welche Primer müssen bestellt werden? welche Nukleotide müssen an den undefinierten Stellen eingesetzt werden? welcher Tm-Wert ist zu wählen? Wie viele PCR-Zyklen sind durchzuführen? Bei welchem Ct-Wert ist die Probe positiv? Und wann ist sie negativ? Und wie viele Gene sind zu testen? Sollen alle Gene getestet werden oder nur das E und das RpRd-Gen, wie in Tabelle 2 des Corman-Drosten-Papiers dargestellt? Sollte auch das N-Gen getestet werden? Und was ist ihre Negativkontrolle? Was ist ihre Positivkontrolle?

Das Protokoll, so wie es beschrieben ist, ist leider sehr vage und fehlerhaft in seinem Design, dass man in Dutzende von verschiedenen Richtungen gehen kann. Es scheint weder eine Standardisierung noch eine SOP zu geben, daher ist nicht klar, wie dieser Test durchgeführt werden kann.

7. Folgen der unter 1-5 beschriebenen Fehler: falsch positive Ergebnisse.

Der im Corman-Drosten-Papier beschriebene RT-PCR-Test enthält so viele molekularbiologische Designfehler (siehe 1-5), dass es nicht möglich ist, eindeutige Ergebnisse zu erhalten. Es ist unvermeidlich, dass dieser Test eine enorme Anzahl so genannter „falsch-positiver Ergebnisse“ erzeugt. Die Definition von „falsch positiv“ ist eine negative Probe, die zunächst ein positives Ergebnis erzielt, aber nach erneuter Prüfung mit demselben Test negativ ist. Falsch-positive Proben sind fehlerhaft positive Testergebnisse, d.h. negative Proben, die einen positiven Test ergeben. Und genau das findet sich in der Tat in der Corman-Drosten-Arbeit. Auf Seite 6 des Manuskript-PDFs zeigen die Autoren, dass selbst unter gut kontrollierten Laborbedingungen ein beträchtlicher Prozentsatz falsch positiver Testergebnisse mit diesem Test erzeugt wird:

„Bei vier einzelnen Testreaktionen wurde eine schwache anfängliche Reaktivität festgestellt, die jedoch bei erneuter Prüfung mit demselben Assay negativ war. Diese Signale waren nicht mit einem bestimmten Virus assoziiert, und für jedes Virus, bei dem eine anfänglich positive Reaktivität auftrat, gab es andere Proben, die dasselbe Virus in einer höheren Konzentration enthielten, aber nicht positiv getestet wurden. Angesichts der Ergebnisse der oben beschriebenen umfangreichen technischen Qualifikation wurde der Schluss gezogen, dass diese anfängliche Reaktivität nicht auf die chemische Instabilität der Real-Time-PCR-Sonden und höchstwahrscheinlich auf Probleme bei der Handhabung zurückzuführen war, die durch die rasche Einführung neuer diagnostischer Tests und Kontrollen während dieser Evaluierungsstudie verursacht wurden“. [1]

Der erste Satz dieses Auszuges ist ein klarer Beweis dafür, dass der im Corman-Drosten-Papier beschriebene PCR-Test falsch positive Ergebnisse erzeugt. Selbst unter den gut kontrollierten Bedingungen des hochmodernen Charité-Labors sind 4 von 310 Primärtests per Definition falsch positiv. Vier negative Proben wurden zunächst positiv getestet und waren dann bei einem erneuten Test negativ. Dies ist das klassische Beispiel eines falsch positiven Ergebnisses. In diesem Fall identifizieren die Autoren sie nicht als falsch positiv, was intellektuell unehrlich ist.

Eine weitere verräterische Beobachtung im obigen Auszug ist, dass die Autoren die falsch positiven Ergebnisse als „Umgang mit Problemen, die durch die rasche Einführung neuer diagnostischer Tests verursacht werden“, wegerklären. Stellen Sie sich die Labors vor, die den Test ohne alle notwendigen Informationen einführen müssen, die normalerweise in einer SOP beschrieben werden.

8. Das Corman-Drosten-Papier wurde nicht peer-reviewed

Vor der formellen Veröffentlichung in einer wissenschaftlichen Zeitschrift werden wissenschaftliche und medizinische Artikel traditionell durch „Peer Review“ zertifiziert. Dabei lassen sich die Herausgeber der Zeitschrift von verschiedenen Experten („Gutachtern“) beraten, die das Papier bewertet haben und möglicherweise Schwachstellen in den Annahmen, Methoden und Schlussfolgerungen identifizieren. In der Regel veröffentlicht eine Zeitschrift einen Artikel erst dann, wenn sich die Herausgeber davon überzeugt haben, dass die Autoren auf die Bedenken der Gutachter eingegangen sind und dass die vorgelegten Daten die in dem Papier gezogenen Schlussfolgerungen unterstützen. Dieser Prozess wird auch für Eurosurveillance beschrieben [16].

Das Corman-Drosten-Papier wurde am 21. Januar 2020 bei Eurosurveillance eingereicht und am 22. Januar 2020 zur Veröffentlichung angenommen. Am 23. Januar 2020 war das Papier online. Am 13. Januar 2020 wurde die Version 1-0 des Protokolls auf der offiziellen Website der WHO veröffentlicht [17] und am 17. Januar 2020 als Dokumentversion 2-1 aktualisiert [18], noch bevor das Corman-Drosten-Papier am 23. Januar bei Eurosurveillance veröffentlicht wurde.

Normalerweise ist die Begutachtung durch Fachkollegen ein zeitaufwändiger Prozess, da mindestens zwei Experten aus der Praxis das eingereichte Papier kritisch lesen und kommentieren müssen. Unseres Erachtens wurde dieses Papier nicht durch ein Peer-Review-Verfahren begutachtet. Vierundzwanzig Stunden reichen einfach nicht aus, um ein gründliches Peer-Review durchzuführen. Unsere Schlussfolgerung wird durch die Tatsache gestützt, dass wir eine enorme Anzahl sehr schwerwiegender Konstruktionsfehler gefunden haben, die den PCR-Test als diagnostisches Instrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus völlig ungeeignet machen. Jeder Molekularbiologe, der mit dem RT-PCR-Design vertraut ist, hätte die schwerwiegenden Fehler, die im Corman-Drosten-Papier enthalten sind, vor dem eigentlichen Überprüfungsprozess leicht beobachtet. Wir baten Eurosurveillance am 26. Oktober 2020, uns eine Kopie des Peer-Review-Berichts zu schicken. Bis heute haben wir diesen Bericht nicht erhalten, und in einem Schreiben vom 18. November 2020 lehnte das ECDC als Gastgeber von Eurosurveillance es ab, Zugang zu gewähren, ohne wesentliche wissenschaftliche Gründe für seine Entscheidung anzugeben. Im Gegenteil, sie schreiben, dass „eine Offenlegung den Zweck der wissenschaftlichen Untersuchungen untergraben würde“. [24].

9. Autoren als Herausgeber

Ein letzter Punkt ist von großer Bedeutung. Es stellt sich heraus, dass zwei Autoren des Corman-Drosten-Papiers, Christian Drosten und Chantal Reusken, auch Mitglieder des Editorial Board dieser Zeitschrift sind [19]. Es besteht also ein schwerer Interessenkonflikt, der den Verdacht erhärtet, dass das Papier nicht von Fachkollegen begutachtet wurde. Es hat den Anschein, dass die rasche Veröffentlichung einfach deshalb möglich war, weil die Autoren auch Teil des Redaktionsausschusses von Eurosurveillance waren. Diese Praxis wird als Beeinträchtigung der wissenschaftlichen Integrität kategorisiert.

ZUSAMMENFASSENDER KATALOG DER IN DEM PAPIER GEFUNDENEN FEHLER

Das Corman-Drosten-Papier enthält die folgenden spezifischen Fehler:

  1. Es gibt keinen spezifizierten Grund, diese extrem hohen Konzentrationen von Primern in diesem Protokoll zu verwenden. Die beschriebenen Konzentrationen führen zu erhöhten unspezifischen Bindungen und PCR-Produktamplifikationen, wodurch der Test als spezifisches diagnostisches Werkzeug zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet ist.
  2. Die verwirrende unspezifische Beschreibung im Corman-Drosten-Papier eignet sich nicht als operationelles Standardprotokoll, wodurch der Test als spezifisches diagnostisches Werkzeug zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet ist.
  3. Der Test kann nicht zwischen dem gesamten Virus und viralen Fragmenten unterscheiden. Daher kann der Test nicht als Diagnostikum für intakte (infektiöse) Viren verwendet werden, was den Test als spezifisches Diagnoseinstrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus und für Rückschlüsse auf das Vorliegen einer Infektion ungeeignet macht.
  4. Ein Unterschied von 10° C in Bezug auf die Annealing-Temperatur Tm für Primerpaar1 (RdRp_SARSr_F und RdRp_SARSr_R) macht den Test auch als spezifisches diagnostisches Werkzeug zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet.
  5. Ein schwerer Fehler ist das Auslassen eines Ct-Wertes, bei dem eine Probe als positiv und negativ betrachtet wird. Dieser Ct-Wert findet sich auch nicht in Folgeanträgen, was den Test als spezifisches Diagnoseinstrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet macht.
  6. Die PCR-Produkte sind nicht auf molekularer Ebene validiert worden. Diese Tatsache macht das Protokoll als spezifisches Diagnoseinstrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus unbrauchbar.
  7. Der PCR-Test enthält weder eine einzigartige Positivkontrolle zur Bewertung seiner Spezifität für SARS-CoV-2 noch eine Negativkontrolle zum Ausschluss anderer Coronaviren, so dass der Test als spezifisches Diagnoseinstrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet ist.
  8. Das Testdesign im Corman-Drosten-Papier ist so vage und fehlerhaft, dass man in Dutzende verschiedene Richtungen gehen kann; nichts ist standardisiert und es gibt keine SOP. Dies stellt die wissenschaftliche Gültigkeit des Tests stark in Frage und macht ihn als spezifisches diagnostisches Instrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet.
  9. Höchstwahrscheinlich wurde das Corman-Drosten-Papier nicht von Fachkollegen begutachtet, was den Test als spezifisches Diagnoseinstrument zur Identifizierung des SARS-CoV-2-Virus ungeeignet macht.
  10. Wir finden schwere Interessenkonflikte bei mindestens vier Autoren, zusätzlich zu der Tatsache, dass zwei der Autoren des Corman-Drosten-Papiers (Christian Drosten und Chantal Reusken) Mitglieder des Redaktionsausschusses von Eurosurveillance sind. Am 29. Juli 2020 kam ein Interessenkonflikt hinzu (Olfert Landt ist CEO von TIB-Molbiol; Marco Kaiser ist Senior Researcher bei GenExpress und fungiert als wissenschaftlicher Berater für TIB-Molbiol), der in der ursprünglichen Fassung nicht angegeben wurde (und in der PubMed-Version noch immer fehlt); TIB-Molbiol ist die Firma, die „die erste“ war, die PCR-Kits (Light Mix) auf der Grundlage des im Corman-Drosten-Manuskript veröffentlichten Protokolls hergestellt hat, und nach eigenen Angaben diese PCR-Testkits bereits vor der Einreichung der Publikation verteilt hat [20]; ferner haben Victor Corman & Christian Drosten ihre zweite Zugehörigkeit nicht erwähnt: das kommerzielle Testlabor „Labor Berlin“. Beide sind dort für die Virusdiagnostik zuständig [21] und das Unternehmen arbeitet im Bereich der Real-Time PCR-Tests.

Im Lichte unserer erneuten Überprüfung des im Corman-Drosten-Papier beschriebenen Testprotokolls zur Identifizierung von SARS-CoV-2 haben wir Fehler und inhärente Irrtümer identifiziert, die den SARS-CoV-2-PCR-Test unbrauchbar machen.

SCHLUSSFOLGERUNG

Die Entscheidung darüber, welche Testprotokolle veröffentlicht und einer breiten Öffentlichkeit zugänglich gemacht werden, liegt ganz in den Händen von Eurosurveillance. Eine Entscheidung, die im Corman-Drosten-Papier offensichtlichen Fehler anzuerkennen, hat den Vorteil, die menschlichen Kosten und das Leiden für die Zukunft stark zu minimieren.

Ist es nicht im besten Interesse von Eurosurveillance, dieses Papier zurückzuziehen? Unsere Schlussfolgerung ist klar. Angesichts all der enormen Designfehler und Irrtümer des PCR-Protokolls, die hier beschrieben werden, kommen wir zu dem Schluss: Im Rahmen der wissenschaftlichen Integrität und Verantwortung gibt es keine große Auswahl mehr.

REFERENZEN

[1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW, Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten Christian. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020;25(3):pii=2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

[2] Email communication between Dr. Peter Borger & Dr. Adam Meijer: Supplementary Material

[3] Jafaar et al., Correlation Between 3790 Quantitative Polymerase Chain Reaction–Positives Samples and Positive Cell Cultures, Including 1941 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Isolates. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603

[4] BBC, January 21st 2020: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836;
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[5] Google Analytics – COVID19-deaths worldwide: https://bit.ly/3fndemJ 
Archive: https://archive.is/PpqEE

[6] Laboratory testing for COVID-19 Emergency Response Technical Centre, NIVD under
China CDC March 15th, 2020: http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf

[7] Real-Time PCR Handbook Life Technologies: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-
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[8] Trestan Pillonel et al, Letter to the editor: SARS-CoV-2 detection by real-time RT-PCR: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/

[9] Kurkela, Satu, and David WG Brown. “Molecular-diagnostic techniques.” Medicine 38.10
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[10] Wolfel et al., Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019
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[11] Thermofischer Primer Dimer Web Tool: https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html

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[12] Primer-BLAST, NCBI – National Center for Biotechnology Information: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

[13] Marra MA, Steven JMJ, Caroline RA, Robert AH, Angela BW et al. (2003) Science. The
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[14] Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete
genome: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947

[15] Borger P. A SARS-like Coronavirus was expected but nothing was done to be prepared. Am J Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf
https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-
like_Coronavirus_was_Expected_but_nothing_was_done_to_be_Prepared

Archive: https://archive.is/i76Hu

[16] Eurosurveillance paper evaluation / review process: https://www.eurosurveillance.org/evaluation

[17] Official recommendation of the Corman-Drosten protocol & manuscript by the WHO,published on January 13th 2020 as version 1.0 of the document:
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus-assay-
v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf
; archive: https://bit.ly/3m3jXVH

[18] Official WHO-recommendation for the Corman / Drosten RT-qPCR-protocol, which
directly derives from the Eurosurveillance-publication, document-version 2-1, published on
17th January 2020: https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-
1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2

[19] Eurosurveillance Editorial Board, 2020: https://www.eurosurveillance.org/upload/site-
assets/imgs/2020-09-Editorial%20Board%20PDF.pdf

Archive: https://bit.ly/2TqXBjX

[20] Instructions For Use LightMix SarbecoV E-gene plus EAV Control, TIB-Molbiol & Roche
Molecular Solutions, January 11th 2020:  https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-
gene_V200204_09164154001 (1).pdf

Archive, timestamp – January 11th 2020: https://archive.is/Vulo5
Archive: https://bit.ly/3fm9bXH

[21] Christian Drosten & Victor Corman, responsible for viral diagnostics at Labor Berlin:
https://www.laborberlin.com/fachbereiche/virologie/ 
Archive: https://archive.is/CDEUG

[22] Tom Jefferson, Elizabeth Spencer, Jon Brassey, Carl Heneghan Viral cultures for COVID-
19 infectivity assessment. Systematic review. Systematic review doi:
https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932  https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4

[23] Kim et al.,The Architecture of SARS-CoV-2 Transcriptome:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062

[24] ECDC reply to Dr. Peter Borger, 18th November 2020: 
Supplementary Material

[25] Prof. Dr. Ulrike Kämmerer & team, survey & Primer-BLAST table: 
Supplementary Material

Additional literature:

Description RT-PCR RKI Germany, on page 10 of this link:
https://www.rki.de/DE/Content/Gesundheitsmonitoring/Gesundheitsberichterstattung/GBE
DownloadsJ/JoHM_S5_2020_Studienprotokoll_CORONA_MONITORING_lokal.pdf?__blob=p
ublicationFile

  1. 1) Dr. Pieter Borger (MSc, PhD), Molecular Genetics, W+W Research Associate, Lörrach, Germany 

    2) Rajesh Kumar Malhotra (Artist Alias: Bobby Rajesh Malhotra), Former 3D Artist / Scientific Visualizations at CeMM – Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences (2019-2020), University for Applied Arts – Department for Digital Arts Vienna, Austria

    3) Dr. Michael Yeadon BSs(Hons) Biochem Tox U Surrey, PhD Pharmacology U Surrey. Managing Director, Yeadon Consulting Ltd, former Pfizer Chief Scientist, United Kingdom 

    4) Dr. Clare Craig MA, (Cantab) BM, BCh (Oxon), FRCPath, United Kingdom

    5) Kevin McKernan, BS Emory University, Chief Scientific Officer, founder Medical Genomics, engineered the sequencing pipeline at WIBR/MIT for the Human Genome Project, Invented and developed the SOLiD sequencer, awarded patents related to PCR, DNA Isolation and Sequencing, USA

    6) Prof. Dr. Klaus Steger, Department of Urology, Pediatric Urology and Andrology, Molecular Andrology, Biomedical Research Center of the Justus Liebig University, Giessen, Germany

    7) Dr. Paul McSheehy (BSc, PhD), Biochemist & Industry Pharmacologist, Loerrach, Germany

    8) Dr. Lidiya Angelova, MSc in Biology, PhD in Microbiology, Former researcher at the National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), Maryland, USA

    9) Dr. Fabio Franchi, Former Dirigente Medico (M.D) in an Infectious Disease Ward, specialized in “Infectious Diseases” and “Hygiene and Preventive Medicine”, Società Scientifica per il Principio di Precauzione (SSPP), Italy

    10) Dr. med. Thomas Binder, Internist and Cardiologist (FMH), Switzerland

    11) Prof. Dr. med. Henrik Ullrich, specialist Diagnostic Radiology, Chief Medical Doctor at the Center for Radiology of Collm Oschatz-Hospital, Germany

    12) Prof. Dr. Makoto Ohashi, Professor emeritus, PhD in Microbiology and Immunology, Tokushima University, Japan

    13) Dr. Stefano Scoglio, B.Sc. Ph.D., Microbiologist, Nutritionist, Italy

    14) Dr. Marjolein Doesburg-van Kleffens (MSc, PhD), specialist in Laboratory Medicine (clinical chemistry), Maasziekenhuis Pantein, Beugen, The Netherlands

    15) Dr. Dorothea Gilbert (MSc, PhD), PhD Environmental Chemistry and Toxicology. DGI Consulting Services, Oslo, Norway

    16) Dr. Rainer J. Klement, PhD. Department of Radiation Oncology, Leopoldina Hospital Schweinfurt, Germany

    17) Dr. Ruth Schruefer, PhD, human genetics/ immunology, Munich, Germany, 

    18) Dra. Berber W. Pieksma, General Practitioner, The Netherlands

    19) Dr. med. Jan Bonte (GJ), Consultant Neurologist, The Netherlands

    20) Dr. Bruno H. Dalle Carbonare (Molecular biologist), IP specialist, BDC Basel, Switzerland

    21) Dr. Kevin P. Corbett, MSc Nursing (Kings College London) PhD (London South Bank) Social Sciences (Science & Technology Studies) London, England, United Kingdom

    22) Prof. Dr. Ulrike Kämmerer, specialist in Virology / Immunology / Human Biology / Cell Biology, University Hospital Würzburg, Germany

  2. Author’s Contributions:
    PB: Planned  and  conducted  the analyses and research, conceptualising  the manuscript.
    BRM: Planned  and  conducted  the research, conceptualising  the figures and manuscript.
    MY: Proofreading the analyses and research.
    KMcK: Conducted  the analyses and research, conceptualized the manuscript.
    KS: Conducted  the analyses and research.
    PMcS: Proofreading the analyses and research.
    LA: Proofreading the analyses and research.
    FF: Proofreading the analyses and research.
    TB: Proofreading the analyses and research.
    HU: Proofreading the analyses and research.
    MO: Proofreading the analyses and research.
    SS: Proofreading the analyses and research.
    MDvK: Proofreading the analyses and research.
    DG: Proofreading the analyses and research.
    RJK: Proofreading the analyses and research.
    RS: Proofreading the analyses and research, and the manuscript.
    BWK: Proofreading the analyses and research.
    RvV: Proofreading the analyses and research.
    JB: Proofreading the analyses and research.
    KC: Proofreading the analyses and research.
    UK: Planned  and  conducted  the analyses and research, conceptualising  the manuscript.